سامانه جامع معاونت فرهنگی اجتماعی | کارگاه وسترن بلات و SDS PAGE

انجمن علمی دانشجویی بيوتكنولوژي

کارگاه وسترن بلات و SDS PAGE

صبا سر گلزايي اول

نوع درخواست:	کارگاه و کلاس آموزشی (دوره علمی و آموزشی)
سطح برگزاری:	کشوری
تاریخ برگزاری:	پنجشنبه, 14 بهمن 1400
مکان برگزاری:	اسکای روم
مدت زمان برنامه(دقیقه):	420
تعداد افراد شرکت کننده:	117

انجمن علمی دانشجویی بیوتکنولوژی معاونت فرهنگی اجتماعی دانشگاه الزهرا (س) "کارگاه وسترن بلات و SDS PAGE"را با هدف افزایش توانمندی دانشجویان در خصوص تکنیک‌های آزمایشگاهی با سخنرانی آقای دکتر رضا فلک در روزهای 14 و 21 بهمن ماه 1400 از ساعت 9 الی 12:30 روز پنج شنبه، با حضور 30 نفر از علاقمندان، روز اول در فضای اسکای روم و روز دوم در فضای بیگ بلو باتن برگزار کرد. این برنامه آموزشی فرهنگی با سخنرانی آقای دکتر رضا فلک دانشیار دانشگاه علوم پزشکی ایران با حضور دانشجویان از دانشگاه الزهرا و دیگر دانشگاه‌ها به اجرا رسید. در ابتدای روز اول، آقای دکتر رضا فلک از شرکت‌کنندگان در رابطه باهدف آن‌ها از شرکت در این کارگاه و پروژه‌هایی که در آن‌ها بر روی پروتئین کار خواهند کرد یا اگر قبلاً در این مورد فعالیت داشته‌اند، سؤال کردند. آماده‌سازی عصاره آقای دکتر رضا فلک توضیحاتی در رابطه با مراحل اولیه دادند. تهیه یک عصاره کامل در اصل اولین مرحله در فرایندهای پروتئینی می‌باشد. اگر این شروع کار به‌درستی انجام نشود، مراحل بعدی کار به مشکل برمی‌خورند؛ زیرا تهیه عصاره به‌اشتباه می‌تواند پروتئین را تخریب کند، آن را در اثر سانتریفیوژ از بین ببرد. این‌ها بخشی از مشکلاتی هستند که در اثر تهیه عصاره نادرست به وجود می‌آیند. بنابراین شروع کارهای ایمونوشیمی عمدتاً با تهیه یک عصاره کامل و تام خواهد بود. بررسی ‌ و آنالیز تهیه یک عصاره کامل یا یک مرحله preparative لازمه این است که ما از درستی انجام این مرحله، اطمینان حاصل کنیم. در روش‌های آزمایشگاهی دو سیستم به وجود آوردند. ۱) روش‌های preparative که در اصل آماده‌سازی هستند. در این مرحله ما چیزی را آماده می‌کنیم تا در مرحله بعدازآن استفاده کنیم. مانند Affinity chromatography ۲) روش Analytical که در اصل چیزی را آماده کرده‌ایم و می‌خواهیم آن را آنالیز کنیم و ببینیم که کیفیت و کمیت مناسب دارد یا خیر. در کل در این مرحله خصوصیات را موردبررسی قرار می‌دهیم؛ مانند electrophoresis برای مثال امروزه برای فاز سوم واکسیناسیون پیشنهادشده از پروتئین‌های نوترکیب کووید ۱۹ استفاده شود. یعنی در دفعات اول از واکسن‌های سینو فارم، برکت، فایزر و غیره استفاده‌شده. امروزه می‌گویند اگر برای فاز سوم از recombinant واکسن‌ها استفاده کنید، هم بی‌دردسر است و هم هزینه و شرایط مناسب و خوبی دارد. در ادامه ایشان اضافه کردند: یکی از واکسن‌هایی که امروزه در کشورمان رایج شده، واکسنی است به نام spikogen. واکسن دیگری هم هست به نام کوو پارس. واکسن دیگر پاستوکووک است که هر سه این واکسن‌ها درواقع واکسن‌های نوترکیب هستند که پروتئین هدف ما در این محلول قرارگرفته و استفاده می‌شود. به‌عنوان‌مثال spikogen برای تولید این پروتئین نوترکیب را تولید کند، از سلول‌های حشرات استفاده می‌کند. در ساده‌ترین روش برای تولید پروتئین نوترکیب این است که ژن آن را در یک پلاسمید وارد کنیم و بعد این پلاسمید را وارد یک باکتری کنیم و باکتری در حین تکثیر، پروتئین نوترکیب ما را هم تولید می‌کند. در ادامه جناب دکتر توضیحات کامل‌تری در رابطه با واکسن‌های ذکرشده دادند. همین‌طور ایشان مثال دیگری را ذکر کردند. سلول U937 که درواقع سلول بلاست میلوئیدی است. با اضافه کردن PMA به این سلول، ساختارش را کمی تغییر داده و به ماکروفاژ تبدیل کردند. هدف، بررسی دلیل تغییر شکل ساختار این سلول از گرد به کشیده و چسبیدن آن به پلیت کشت سلولی مورداستفاده است. ساده‌ترین کاری که می‌شود انجام داد استفاده از electrophoresis است. آیا پروتئین خاصی در این سلول ایجادشده که باعث شده که قدرت چسبناکی و ساختار سلول تغییر کند؟ Electrophoresis در ادامه جناب دکتر رضا فلک به electrophoresis پرداختند که به‌صورت مختصر توضیح می‌دهیم. electrophoresis حرکت مولکول‌های باردار در یک مسیر و جریان الکتریکی است. یعنی اگر مولکول ما باردار باشد، اگر آن را در جریانی الکتریکی قرار دهیم باعث می‌شود که حرکت کند. آن‌هایی که بار مثبت دارند به سمت قطب منفی و آن‌هایی که بار منفی دارند به سمت قطب مثبت می‌روند. پروتئین‌ها از اجزایی تشکیل‌شده‌اند که قسمت‌هایی از این اجزا بار مثبت و قسمت‌هایی از آن‌ها باز منفی دارند. این‌ها درواقع از اسیدآمینه‌هایی تشکیل‌شده‌اند که بعضی از این اسیدآمینه‌ها، بار منفی و بعضی بار مثبت دارند. در ادامه ایشان به SPE یا serum protein electrophoresis اشاره کردند که در بیماری‌های گاماپاتی و افرادی که مشکلات کلیوی دارند استفاده می‌شود. در اینجا می‌شود وضعیت ساختار پروتئین‌ها را نشان داد. در ادامه در رابطه با zone electrophoresis و حساسیت electrophoresis صحبت شد. برای تهیه ژل agarose باید آن را در آب حل کرد و آن را به مدت یک دقیقه جوشاند. سپس در ظرفی ریخت که حالت ژله‌ای پیدا کند. اینجا اتصالات به‌صورت غیر کووالانت خواهند بود و مولکول‌ها به‌صورت غیر کووالانت در کنار هم قرارگرفته و متصل شده‌اند. حفراتی که وجود دارند تفاوت اندازه دارند. یعنی بعضی بزرگ و بعضی کوچک هستند که کیفیت مناسب (حفره‌های یکسان) را ندارد. برعکس در ژل polyacrylamide اتصالات کووالانت هستند و به‌صورت cross- link به هم متصل شده‌اند که حفرات در آن به‌طور یکسان قرارگرفته‌اند و جواب‌های بهتری به ما می‌دهند. ژل polyacrylamide از ادغام مولکول‌های acrylamide و bis-acrylamide تهیه می‌شود. ایشان همین‌طور در رابطه با مراحل SDS-PAGE صحبت کردند. مرحله اول آماده‌سازی است که در آن دو ژل separating (تفکیک‌کننده) و stacking (متراکم کننده) درست می‌شوند. در مرحله دوم نمونه موردنظر باید آماده شود که در اینجا نمونه را با sample buffer مخلوط می‌کنیم که در اصل این sample buffer حاوی موادی است که باعث می‌شود ساختار پروتئین به هم بریزد و دچار unfolding شود. در این مرحله آماده سازی subunitهای پروتئین از هم جدا می‌شوند. در مرحله سوم با استفاده از روش electrophoresis پروتئین‌ها را جدا می‌کنیم. سپس پروتئین‌ها را رنگ‌آمیزی کرده و قابل‌مشاهده می‌کنیم. درنهایت هم نتایج را بررسی و تحلیل می‌کنیم. سپس آقای دکتر رضا فلک این مراحل را به‌طور دقیق‌تر و جزئی‌تر توضیح دادند. APS & TEMED آمونیوم پرسولفات یا APS یک ماده اکسیده کننده قوی است و رادیکال‌های آزادی را ایجاد می‌کند که می‌تواند پلی مریزیشن را انجام دهد. برای اتفاق افتادن این موضوع و شروع فرایند اکسیدکنندگی نیاز به یک کاتالیزور دارد. کاتالیزور مورداستفاده در اینجا تترا متیلن دی آمین است که به آن TEMED می‌گوییم. در ادامه آقای دکتر افزودند: ما در محتویاتمان بافر هم داشتیم که pH مشخص و ثابتی به محلول ما می‌دهد. بافر استفاده‌شده در اینجا بافر tris است درواقع برای اینکه pH را تنظیم کنیم از اسیدکلریدریک استفاده می‌کنیم. Polyacrylamide gel خود این ماده قبل از پلیمریزه شدن بسیار سمی است، پس اجزای مونومری این محلول حالت سمی دارند و باید هنگام کار کردن با آن‌ها دقت و توجه کرد. پس از ایجاد اتصال حالت سمی خود را تا حدودی از دست می‌دهد ولی بازهم باید رعایت کرد. نسبت‌های متفاوت این ژل کاربردهای متفاوتی دارد. Porosity به میزان حفرات ایجادشده در ژل porosity گفته می‌شود. این در اصل به خود ژل برمی‌گردد و دو خصوصیت موردبررسی قرار می‌گیرند. غلظت ژل و نسبت acrylamide به Bis-acrylamide که درواقع در اندازه‌گیری این حفره‌ها نقش دارند. Bis-acrylamide تأثیر بسیار کم و غیرقابل‌پیش‌بینی‌تری دارد. آقای دکتر رضا فلک به صحبت درباره مرحله دوم پرداختند: در مرحله اول به آماده‌سازی ژن پرداختیم. در مرحله دوم روی آماده‌سازی نمونه موردنظر برای electrophoresis تمرکز می‌کنیم. اول عصاره یا لیزات سلول را آماده می‌کنیم. پس از لیز کردن سلول غلظت پروتئین را سنجیده و مقدار مشخصی از آن را روی ژن لود می‌کنیم. ایشان توضیحات تکمیلی در رابطه با آماده‌سازی در مرحله دوم را خدمت شرکت‌کنندگان ارائه دادند و درباره SDS صحبت کردند. اندازه و شکل پروتئین‌ها بر حرکت آن‌ها در electrophoresis تأثیر می‌گذارد. هر مولکول SDS به حدود دو اسیدآمینه متصل می‌شود، بنابراین همه مولکول‌های ما یک‌بار منفی یکسانی خواهند داشت. SDS-PAGE پروتئین‌ها که از چند زیر واحد تشکیل‌شده‌اند. اتصال غیر کووالانت زیر واحدها توسط SDS حذف می‌شود. همین‌طور اتصال کووالانت پیوند دی سولفیدی توسط DTT/2ME شکسته می‌شود. Zymography زایموگرافی یک تکنیک الکتروفورتیک برای تشخیص آنزیم‌های هیدرولیتیک است که بر اساس مجموعه سوبسترای آنزیم است.سه نوع زایموگرافی استفاده می‌شود. در زایموگرافی ژل، زایموگرافی درجا و زایموگرافی در vivo به‌عنوان‌مثال، ژلاتین جاسازی‌شده در ژل پلی آکریل آمید توسط ژلاتیناز های فعالی که از ژل عبور می‌کنند هضم می‌شود. پس از رنگ‌آمیزی کوماسی، نواحی تخریب به‌صورت نوارهای شفاف در برابر پس‌زمینه تیره‌رنگی قابل‌مشاهده است. در ادامه در رابطه با زایموگرافی، electrophoresis و الکترودها و بافرها بیشتر بحث شد. رنگ‌آمیزی ایشان در رابطه با رنگ‌آمیزی گفتند: از هر ماده‌ای که بتواند گلیکوپروتئین ها و لیپوپروتئین‌ها را رنگ کند، می‌توانیم استفاده کنیم. بهترین رنگ‌آمیزی برای ابتدای کار Coomassie blue است که به دو فرم G250 و R250 وجود دارد. R250 از کلمه red می‌آید و رنگ‌آمیزی هم که انجام می‌شود کمی قرمز هم درزمینه وجود خواهد داشت. G هم از green می‌آید که رنگ زمینه را مایل به سبز می‌کند. غیرازاین روش رنگ‌آمیزی، روش‌های silver nitrate و Sypro ruby هم مورداستفاده قرار می‌گیرند. Staining & De-staining Coomassie blue از طریق آرژنین و آمینواسیدهای آروماتیک به پروتئین‌ها پیوند می‌خورد. آنالیز و بررسی درنهایت نتایج و مشاهدات خود را موردبررسی قرار می‌دهیم و آن‌ها را آنالیز می‌کنیم. پروتئین‌ها با توجه به سایزشان جداشده‌اند. غلظت کمتر acrylamide باعث حرکت آسان‌تر پروتئین‌ها در ژل می‌شود. کاربردهای SDS-PAGE مهم‌ترین کاربرد، به دست آوردن وزن مولکولی ظاهری پروتئین‌ها است و در ادامه درباره تشخیص پروتئین، تعیین خلوص نمونه، تشخیص حضور پیوندهای دی سولفید، سنجیدن غلظت پروتئین، مقایسه پروتئین‌ها با منابع مختلف و وسترن بلاتینگ که از کاربردهای SDS-PAGE هستند، صحبت کردند. SDS-PAGE قابل‌قبول در رابطه با SDS-PAGE قابل‌قبول، آقای دکتر رضا فلک فرمودند: باندها از همدیگر قابل‌تفکیک باشند. پروتئین‌ها جداشده باشند و حرکت خوبی داشته باشند. میزان حرکت پروتئین از ابتدا تا انتها به صورتی باشد که از ژل خارج نشود و پترن خوبی ایجاد کرده باشد. اگر پروتئین‌ها خیلی کوچک یا خیلی بزرگ باشند، درصد ژل خیلی اهمیت پیدا می‌کند. سپس درباره سیستم الکتروفورسیس continuous و discontinuous، ویژگی‌های محیطی برای الکتروفورز، عوامل مؤثر در پلیمریزاسیون acrylamide، درصد مناسب ژل و میزان لود صحبت شد. در نهایت ایشان با نشان دادن نمونه‌هایی از رنگ آمیزی هایی، مراحل به درستی انجام نشده و نتیجه آن‌ها را در پایان کار نشان دادند و جلسه را به پایان رساندند. در روز دوم کارگاه مسائل مربوط به وسترن بلات مطرح شد. به‌طور خلاصه از تاریخچه این روش صحبت شد. پس از تعریف تئوری این روش، مراحل و نکات مهم روش عملی ذکر شد. در ادامه به روش عصاره گیری اشاره شد. در مورد الکتروترنسفر و Immunodetection نیز صحبت شد. در انتها نکات کاربردی که در کار عملی ممکن است با آن برخورد شود ارائه شد. به‌طور دقیق‌تر در ابتدای جلسه از شرکت‌کنندگان سؤال شد که آیا تابه‌حال در این زمینه کار عملی انجام داده‌اند یا تمایل به کاربرد آن در پروژه‌های آتی خوددارند یا فقط مایل به یادگیری این روش هستند و اینکه در کارگاه SDS PAGE شرکت کرده‌اند؟ سپس با در نظر گرفتن پاسخ شرکت‌کنندگان آقای دکتر رضا فلک شروع به ارائه توضیحاتی درباره تاریخچه روش وسترن بلات کردند. ایشان توضیح دادند که وسترن بلات یک تست Immunoassay است. تست‌های Immunoassay در تشخیص طبی کاربرد دارند و این تست‌های سرولوژی به سه دسته تقسیم می‌شوند: واکنش‌های اولیه (همانند الیزا، کمی لومینسانس و الکترو کمی لومینسانس)، واکنش‌های ثانویه (همانند CRP، لاتکس و رایت) و واکنش‌های ثالثیه. ایشان مطرح کردند که واکنش‌های ثانویه ساده‌تر هستند و اساس آن به‌اندازه ذرات آنتی‌ژن برمی‌گردد. اگر آنتی‌بادی به ذرات بزرگ (مثل گلبول قرمز و باکتری‌ها) متصل شود به‌راحتی می‌توانیم تشخیص بدهیم که اتصال صورت گرفته است. اگر قصد داشته باشیم واکنش ثانویه را روی پروتئین‌ها انجام بدهیم آنگاه استفاده از تست‌هایی مثل Immunodiffusion بیشتر اهمیت پیدا می‌کند. آقای دکتر رضا فلک به لزوم دسترسی به پروتئین خالص اشاره کردند اما افزودند که دسترسی به پروتئین خالص همیشه مقدور نیست. جداسازی و خالص کردن پروتئین‌ها بسیار پرهزینه و وقت‌گیر است. یکی از راه‌های ساده این است که با اایمونولکتروفورز پروتئین‌ها را از هم جدا کنیم. در دوره‌های بعدی برای تسریع کار از روش ایمونوفیکسیشن استفاده شد. اما این روش‌ها با مشکلاتی ازجمله زمان، مصرف زیاد آنتی‌بادی، قابل‌مشاهده بودن نتیجه و نگهداری ژل همراه بوده است. بنابراین امروزه وسترن بلات جایگزین خوبی برای این روش‌ها شده است. ایشان در ادامه فرمودند که وسترن بلات یک تست کیفی است و گاهی می‌توانیم آن را تبدیل به حالت نیمه کمی بکنیم. وسترن بلات یک واکنش اولیه Immunoassay است که اتصال تک‌تک آنتی‌ژن‌ها به تک‌تک آنتی‌بادی‌ها کافی است درصورتی‌که در واکنش‌های ثانویه لازم بود تا حجم زیادی از آنتی‌بادی (آشکارساز) و آنتی‌ژن (پروتئین) وجود داشته باشد و بتوانند کمپلکس‌های بزرگی را تشکیل بدهند که بتوانیم واکنش انجام‌شده را با چشم تشخیص دهیم. آقای دکتر رضا فلک برای اشاره به موارد کاربرد این تست فرمودند که گاهی آنتی‌ژن موردبررسی مشخص است و آنتی‌بادی نامشخص است و بالعکس گاهی آنتی‌ژن نامشخص است. گاهی قصد داریم میزان آنتی‌ژن را مشخص کنیم. در این موارد از وسترن بلات استفاده می‌کنیم. مراحل وسترن بلات آقای دکتر رضا فلک در ادامه به توضیحات مفصل درباره مراحل وسترن بلات پرداختند. اولین مرحله مربوط به انجام الکتروفورز است. ایشان اشاره کردند در صورت استفاده از روش الیزا بسیار هزینه بر است درحالی‌که اگر از وسترن بلات استفاده کنند هزینه‌ها کاهش خواهد یافت. برای این کار باید ابتدا لیز سلولی انجام‌شده و سپس الکتروفورز انجام شود. برای انجام یک الکتروفورز مناسب از SDS PAGE استفاده می‌شود که پروتئین‌ها به‌طور دقیقی بر اساس بار الکتریکی و وزن مولکولی جدا خوهند شد. ازآنجایی‌که مولکول‌های کوچک سریع حرکت می‌کنند در منطقه پایینی قرار خواهند گرفت و مولکول‌های بزرگ‌تر در نواحی بالاتری باقی می‌مانند. باندهای ایجادشده که در صورت رنگ‌آمیزی قابل‌مشاهده می‌شوند، برای هر سلول یک الگوی خاص را نشان می‌دهد (البته این رنگ‌آمیزی برای وسترن بلات لازم نیست). سپس درباره مرحله دوم توضیح دادند که در این مرحله قصد داریم پروتئین‌ها را روی غشای نیتروسلولزی (دارای ساختاری شبیه کاغذ) یا نایلون PVDF(دارای ساختاری شبیه پلاستیک) انتقال بدهیم. ایشان افزودند که در صورت استفاده از PVDF باید ابتدا در متانول قرار گیرد تا حالت آب‌گریز نداشته باشد. مرحله دوم که به‌این‌ترتیب قابل انجام است Electrotransfer نام دارد. در انتقال پروتئین‌ها از روی ژل بر روی غشای نیتروسلولزی از جریان الکتریکی با آمپراژ ثابت استفاده می‌شود. آقای دکتر فلک به لزوم برقراری جریان الکتریکی از سمت ژل به غشا اشاره کردند. انواع سیستم‌های Electrotransfer نیز توضیح داده شد. ایشان به این نکته اشاره کردند که در پایان این مرحله، از باقی‌مانده ژل رنگ‌آمیزی انجام می‌شود تا از کیفیت انتقال پروتئین‌ها اطمینان حاصل شود. سپس به مرحله سوم که Protein-Protein Interaction نام دارد اشاره شد. در این مرحله واکنش پروتئین موردنظر با پروتئین دیگر مطرح می‌باشد. در مقایسه با روش الیزا که در اولین مرحله آن، آنتی‌ژن را به چاهک‌ها متصل می‌کنیم و در مرحله بعدی Blocking قسمت‌هایی که پروتئین وجود ندارد بادی انجام می‌شود باید توجه داشت در وسترن بلات پس‌ازاینکه پروتئین‌ها روی کاغذ انتقال‌یافته‌اند باید Blocking انجام شود. ایشان به انواع ترکیباتی که به‌منظور Blocking استفاده می‌شود اشاره کردند و افزودند که به‌این‌ترتیب جایگاه‌های خالی با پروتئین‌های خنثی پوشانده می‌شود. در ادامه توضیح داده شد که باید یک آنتی‌بادی به‌عنوان آنتی‌بادی اولیه متصل به پروتئین موردنظر شود. این آنتی‌بادی اضافه‌شده علیه آنتی‌ژن هدف هست. ایشان در ادامه توضیح دادند که در مرحله بعدی باید از یک آنتی‌بادی ثانویه همراه با یک label همانند فلورسنت استفاده کرد که به‌این‌ترتیب بتواند آنتی‌بادی اولیه اضافه‌شده را تشخیص بدهد. این مرحله Visualization نام دارد. سپس بیان کردند که در این مرحله، وابسته به نوع label متصل به آنتی‌بادی ثانویه (که عموماً آنزیم است)، سوبسترا انتخاب می‌شود و به سوبستراهای رایج مورداستفاده نیز اشاره شد. به این نکات مهم که نباید در سراسر مراحل کاغذ وسترن بلات خشک شود نیز اشاره کردند. عصاره گیری سلولی آقای دکتر رضا فلک درباره عصاره گیری از سلول توضیحاتی ارائه دادند. به‌طور مختصر این‌که Total Extract یا عصاره تام، مخلوطی از پروتئین‌های قابل‌استخراج است که اولین قدم برای انجام یک SDS PAGE و به دنبال آن ‌یک وسترن بلات درست است. با توجه به محل پروتئین موردنظر لیز سلولی اتفاق می‌افتد و در این هنگام باید به پارامتری مانند دما توجه داشت چراکه دمای بالای 4 درجه ممکن آسیب‌رسان باشد. pH نیز دارای اهمیت است. نکته قابل‌توجه که به آن اشاره شد این است که به یک بافر مناسب در این مرحله نیاز است. آقای دکتر فلک محلول Salty TGED را معرفی کردند که شامل مواد نگهدارنده، شلاته کننده (برای غیرفعال کردن پروتئازها)، احیاکننده (جایگزین گلوتاتیون اکسید و احیا) و مقداری نمک (برای حفظ ساختار پروتئین) است. همچنین ایشان افزودند که برای تهیه یک محلول تجاری به‌جای سنتز آن، به‌طورمعمول می‌توان از محلول RIPA استفاده کرد. البته توضیح دادند که وابسته به محل پروتئین موردنظر، باید از محلول خاصی استفاده کرد. آقای دکتر فلک بیان کردند که علاوه بر این محلول‌ها باید از مهارکننده پروتئاز و فسفاتاز نیز استفاده شود. مهارکننده تک‌تک پروتئاز ها یا مخلوطی از آن‌ها مثل PMSF یا EDTA که عموماً در دسترس هستند می‌توانند استفاده شوند. نهایتاً برای لیز سلولی می‌توان از روش‌هایی مثل فریز و دفریز، آنزیم‌ها، لیز اسمزی و ... استفاده کرد. پس از توضیحات عصاره گیری سلولی آقای دکتر رضا فلک درباره روش Dot plot و Line Blotting توضیح مختصری ارائه دادند. ازجمله اینکه Dot plot شبیه به روش الیزا است که برخلاف وسترن بلات ساختار پروتئین در آن سه‌بعدی است. Line Blotting برای تشخیص بیماری‌های آلرژیک و خود ایمنی با سرم بیمار استفاده می‌شود. باندی که تشکیل می‌شود نشان می‌دهد بیمار به چه ماده‌ای حساسیت دارد. آقای دکتر رضا فلک در انتهای کارگاه به بیان نکاتی درباره انواع چالش‌هایی که ممکن است حین به کار بردن این روش اتفاق بیفتد اشاره کرند و راه‌حل‌هایی در رابطه با آن ارائه دادند. ازجمله آنکه باندهای ایجادشده روی کاغذ باید حالت فرورفته داشته باشند. اگر خلاف این مورد باشد غلظت نمک و دما مناسب نبوده است. ایشان درباره مواردی مثل‌اینکه بافرهای مورداستفاده برای غشای نیتروسلولزی و PVDF تا حدوی متفاوت هستند و مواردی از قبیل اهمیت حذف حباب‌های ایجادشده در مراحل اشاره کردند.

لینک های مفید

معاونت فرهنگی و اجتماعی دانشگاه الزهرا(س)